[실험-실전] 급성 위염 모델에서 한약재의 효과 평가를 위한 동물 실험 1탄

오늘은 동물실험으로 분주한 하루였습니다. 실험을 원활하게 진행하기 위해 어제 미리 절식판을 깔고 동물들을 절식시켰으며, 혈액 채취를 위한 튜브와 주사기, 실험 도구, 생리식염수, 70% 알코올 등을 준비해 두었습니다. 덕분에 큰 어려움 없이 실험을 진행할 수 있었네요. 이번 실험은 급성 위염 모델에서 한약재의 효과를 평가하기 위한 동물실험으로, 실험 과정과 방법을 간단히 소개해 보려고 합니다.

1. 실험동물 

본 연구에서는 급성 위염 모델에서 한약재의 효과를 확인하기 위해 6 주령의 ICR 수컷 마우스(20-25 g 내외)를 사용하였습니다. 실험동물은 1주일간 사육실에서 적응 기간을 거친 후 본 실험에 투입되었습니다. (명암사이클은 12h/12h이고요)

✅ SMR의 한마디: 실험에 사용한 ICR (Institute of Cancer Research) 마우스는 스위스 계열(Swiss albino) 마우스로, 유전적 다양성이 높아 일반적인 생리 연구 및 독성 연구에 널리 사용됩니다. 또한, 번식력이 뛰어나고 성장 속도가 빠르며, 가격이 가장 저렴한 실험동물 중 하나입니다. 하얀색 털을 가지고 있는 것이 특징입니다.

📌 ICR 마우스 가격(6 주령 기준 그 이상 주령)

• 국내 생산: 마리당 6,000원 +α
• 일본 수입: 마리당 32,000원 +α 
• 주령(나이)에 따라 500~1,000원 추가 비용 발생

이와 달리, 검은색 털을 가진 C57BL/6 마우스는 유전적 균일성이 높아 면역학 및 유전자 연구에 많이 사용됩니다.  저 같은 경우엔 식이 유발 비만, 비알코올성 지방간 NAFLD) 현재는 (DIO) 및 만성 자가면역 뇌수막염(EAE), 다발성 경화증(MS) 연구에 적합하며, 대식세포는 탄저병 치사 독소에 내성을 갖고 있습니다. 🐭

* (참고) NAFLD(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease, 비알코올성 지방간질환)는 최근 MASLD (Metabolic dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease, 대사기능이상 연관 지방간질환)로 명칭이 변경되었습니다. 이는 비알코올성 지방간질환이 단순히 알코올과 무관한 지방간을 의미하는 것이 아니라, 대사 장애(비만, 인슐린 저항성 등)와 밀접한 관련이 있음을 강조하기 위해 바뀐 것입니다 (2020. 11.)

✅ SMR의 한마디: 실험에서 수컷 마우스를 주로 사용하는 이유는 호르몬의 영향을 덜 받기 때문이에요. 암컷 마우스는 생리 주기와 호르몬 변화가 실험 결과에 영향을 미칠 수 있어, 호르몬이 실험 변수로 작용할 수 있어요. 반면 수컷 마우스는 호르몬 변화가 상대적으로 일정하고 예측 가능하므로, 실험 결과의 일관성을 유지하기 위해 수컷을 사용하는 경우가 많습니다. 따라서, 호르몬 변화가 실험 변수로 영향을 미치는 것을 최소화하기 위해 수컷을 사용하는 것이 일반적입니다.

암컷 마우스는 호르몬의 영향을 받는 질환 모델에서 주로 사용됩니다. 저희가 진행한 실험은 난소적출을 통한 골다공증 동물모델에서 그 효과와 기전을 연구한 것이었습니다. 그럼 주요 암컷 사용 예시는 아래와 같습니다:

1. 호르몬 의존성 질환 모델
   암컷은 유방암, 자궁내막암 등 호르몬에 의존적인 질환 연구에서 널리 사용됩니다. 이러한 질환들은 에스트로겐과 같은 호르몬의 영향을 받기 때문에, 호르몬 수치 변화가 실험에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다. 특히 호르몬 수용체와 관련된 연구에서 암컷은 매우 유용하게 활용됩니다.
2. 임신과 관련된 연구
   임신성 고혈압, 임신성 당뇨병 등 임신과 관련된 질환을 연구할 때도 암컷을 사용합니다. 호르몬 변화와 임신 과정에서 발생하는 생리적 변화를 연구하는 데 중요한 모델로 사용되며, 임신에 따른 호르몬 변화가 실험 변수로 작용하기 때문에 이를 반영할 수 있는 암컷이 적합합니다.
3. 생리 주기 및 면역학 연구
   생리 주기가 실험에 영향을 미치는 연구나 자가면역 질환 모델 연구에서도 암컷이 사용됩니다. 생리 주기에 따른 호르몬 변화가 면역 반응에 미치는 영향을 연구하거나, 에스트로겐이 면역 기능에 미치는 영향을 분석할 때 암컷을 선택합니다. 호르몬 주기가 실험 결과에 중요한 영향을 미치기 때문에, 이를 반영하기 위해 암컷이 유리합니다.

이처럼, 암컷은 호르몬 변화가 중요한 연구에서 주로 사용되며, 연구의 목적에 맞는 적합한 모델로 활용됩니다.

 

2. 실험군 분류 및 처치 방법

마우스는 무작위로 각 군당 8마리씩 5개 군으로 나누어 실험을 진행하였습니다.

1. 정상 대조군(Control): 아무런 처치를 하지 않은 군
2. 급성 위염 유발군(Control): 증류수를 경구 투여+ 급성 위염 유발
3. 양성 대조군(SC): Sucralfate 10 mg/kg 경구 투여 + 급성 위염 유발
4. 저농도 투여군(L): 한약재 100 mg/kg 경구 투여 + 급성 위염 유발
5. 고농도 투여군(H): 한약재 200 mg/kg 경구 투여 + 급성 위염 유발

3. 실험 과정

• 모든 실험동물은 실험 전 15시간 절식하였으며, 물만 공급하였습니다.
• 이후, 각 군에 해당하는 약물을 경구 투여한 후 90분 경과 후 급성 위염을 유발하기 위해 150 mM HCl과 60% ethanol을 혼합한 용액(550 μL)을 경구 투여하였습니다.
• 위염 유발 90분 후, isoflurane을 이용한 흡입 마취를 시행하였으며, 심장에서 혈액을 채취하였습니다.
• 채취한 혈액은 4,000 rpm, 4°C에서 10분간 원심 분리하여 혈청을 분리한 후 보관하였습니다.
• 또한, 실험동물에서 위 조직을 적출하여 −80°C에서 냉동 보관한 후 추후 분석을 진행하였습니다.

✅ SMR의 한마디: 약물 투여는 Zonde를 이용해 진행합니다. Zonde는 일반적으로 스테인리스 스틸로 제작되며, 내구성이 높고 세척 및 재사용이 가능해 실험에서 자주 사용됩니다. 일부 제품은 플라스틱 재질로도 출시되지만, 대부분의 실험에서는 스테인리스 스틸이 더 선호됩니다. 예전에 플라스틱 Zonde를 사용해 본 적이 있는데, 스틸보다 덜 자극적일 것 같아 시도해 봤습니다. 하지만 숙련되지 않은 상태에서 사용하면(초보자) 플라스틱을 뜯어 Zonde를 삼켜버리는 문제가 발생할 수도 있더군요. 결국, 가장 중요한 것은 마우스를 정확하게 보정한 후, 빠르고 정확하게 투여하는 것입니다. 마우스 보정을 제대로 하지 않으면 동물이 스트레스를 받아 실험 결과에도 영향을 줄 수 있습니다. 또한, 투여가 잘못되면 기도로 넘어가 질식을 유발할 수도 있고, 식도를 과하게 자극해 마우스가 식사를 거부하는 문제도 발생할 수 있습니다. 심지어 사람이 물릴 위험도 있으니 항상 신중하게 접근해야 합니다. 결론적으로, 빠르고 정확한 투여가 핵심이며, 이를 위해선 꾸준한 연습과 숙련된 보정 기술이 필수입니다.

급성 위염은 크게 세 가지 모델로 나뉩니다. 첫째, 순수 알코올을 사용해 유발하는 급성 위염, 둘째, 혼합 용액(mix solution)을 이용한 급성 위염, 셋째, 비스테로이드성 소염제(NSAIDs)를 통해 유발하는 모델이 있습니다. 이번 실험에서는 그중 혼합 용액을 이용해 급성 위염을 유발했습니다.

알코올 식이를 이용하는 방법도 있지만, 여러 가지 번거로운 점이 있어 저는 사용하지 않기로 했습니다.

1. 일정한 시간에 식이를 제공해야 한다는 점(주말도 예외 없음)
2. 튜브에 넣을 때 입구를 막지 않으면 내용물이 분출되어 난장판이 될 수 있다는 점
3. 튜브를 불려 세척하고, 식이를 믹서기로 가는 등 추가적인 작업이 많다는 점
4. 깔짚(베딩)에 의해 급이 구멍이 막힐 수 있다는 점

이런 애로사항이 많아 알코올 식이 모델은 과감히 포기했습니다. 😅

4. 급성위염 유발 Mix solution 제조 

✅ SMR의 한마디:  그럼 mix solution을 만들어볼게요. 예시에는 150 mM HCl 제조방법을 말하려고 한 것이기에 베이스는 물임. 

150 mM HCl을 계산하려면 일단 1M HCl을 계산해야겠지요. 일단  염화수소(HCl) 기체 vs. 염산(HCl 수용액) HCl은 기체 상태로 존재하지만, 일반적으로 실험에서는 염산(수용액 형태)을 사용합니다. 이를 먼저 안 후, 계산을 들어가 볼게요. 

✅ 1M HCl 용액 제조 계산 

이유? 고농도의 HCl을 사용하면 반응 속도가 너무 빨라져 정확한 조절이 어렵고, 원하는 실험 결과를 얻기 힘듭니다. 일반적으로 적정 반응, 용액 제조, 산-염기 반응 실험 등에서는 1M과 같은 적절한 농도의 HCl을 사용해야 정확한 데이터를 얻을 수 있습니다. 또한, 고농도 HCl은 피부나 점막에 닿으면 심각한 화상을 입힐 수 있으며, 휘발성이 강해 자극이 심하기 때문에 취급이 용이한 1M과 같은 희석된 농도를 사용하는 것이 더 안전합니다. 고농도 산을 사용하면 용액 조절이 어렵고, 과한 반응이 일어날 수 있기 때문에 실험 목적에 맞게 1M으로 희석하여 조정하는 것입니다.

• 1M HCl 용액이란? 1M(1몰 농도) 용액은 용액 1L(1000mL) 당 용질인 HCl이 1몰 포함된 농도입니다.
• HCl의 분자량은 36.46g/mol
• 1몰은 36.46g이므로, 1M HCl 용액 1L를 만들기 위해서는 HCl 36.46g이 필요합니다.
• 37% 염산 83.5mL를 메스플라스크나 비커에 넣고, 그 후 증류수를 추가하여 총부피가 1L가 되도록 맞추면 1M HCl 용액을 완성할 수 있습니다 (이건 아래 계산식보면 알아요). 용액을 잘 저어준 후 사용하며, 염산을 취급할 때는 반드시 보호장갑, 보안경착용 후 후드 사용 필수!
• 염산을 물에 부어 희석 때 주의사항: "산을 물에!" (Acid into Water)/ 물을 먼저 넣고 염산을 천천히 추가!/ (반대는 위험⚠️).

✅ 밀도(1.18 g/mL)를 이용해 부피(mL)와 질량(g)을 변환

밀도를 활용한 순수한 HCl의 질량 계산 (상업적으로 구할 수 있는 실험실용 HCl은 37% HCl, 밀도 1.18g/mL임. 이는 염산 농도가 37%인 수용액에서 1mL의 염산 용액이 약 1.18g의 질량을 가진다는 의미)

37% 염산의 의미는 37% w/w(질량비, weight/weight)로, 이는 염산 100g 중 37g이 순수한 HCl이 포함되어 있다는 뜻입니다. 하지만 실험실에서는 용액을 부피 단위(ml)로 측정하는 경우가 많기 때문에, 질량을 부피로 변환하기 위해 밀도(1.18 g/mL) 값을 사용해야 합니다. 이 밀도를 이용해 37% 염산의 부피당 질량을 계산할 수 있으며, 이를 바탕으로 필요한 양을 정확하게 측정할 수 있습니다. 

1. 밀도를 이용해 100mL 염산의 질량을 구함
2. 질량=부피 ×밀도=100mL×1.18g/mL=118g→ 100mL 염산의 질량은 118g
3. 100mL 염산에 포함된 순수 HCl의 질량 계산
   • 37% 염산이므로, 염산 118g 중 37%가 HCl
   118 g×0.37=43.66g→ 100mL 염산에는 43.66g의 HCl이 포함됨
4. 1M HCl(36.46g HCl 포함)을 만들려면?
   • 필요한 HCl 양: 36.46g
   • 100mL 염산에는 43.66g의 HCl이 포함됨
   • 따라서, 필요한 염산의 부피 36.46g/43.66 g×100mL=83.5mL
   • 즉, 37% 염산 83.5mL를 물에 희석하여 1L로 만들면 1M HCl 완성! 

✅ 다른 부피를 만들기 (1M HCl을 150 mM HCl로): 희석법

• 100mL를 만들기 → 1M HCl 15mL + 증류수 85mL → 최종 100mL
• 500mL 만들기 → 1M HCl 75mL + 물 425mL
• 1L 만들기 → 1M HCl 150mL + 물 850mL

이제 급성 위염 유발을 할 수 있게 되었네요. mix solution 내용 때문에 길어졌네요. 이후는 다음 글에...